許多生物分子只有在水溶液中才具有活性,脫水后不僅其生物活性發生很大變化,它們的結構也會發生某些變化。因此,活性生物分子的研究中,溶劑水具有不可替代性。水是強極性分子,在3400和1640cm-1區域出現寬且強的紅外吸收譜帶,水的吸收帶常與感興趣的生物分子吸收譜帶發生重疊或部分重疊,致使生物分子的紅外光譜研究復雜化和高度困難。在早期的紅外教科書中常常說“紅外光譜不適合于水溶液或含水物質的分析”,說明了水峰干擾的嚴重性。許多實際工作中,為得到感興趣物質的高質量紅外光譜,水的紅外吸收峰(干擾峰)必須扣除掉。

去掉水吸收譜帶的方法之一是用氘代水(D2O)替代水(H2O)作溶劑。由于同位素效應,D2O與H2O的紅外譜帶位置明顯不同。然而,許多生物分子中存在活性氫(—COOH,—NH2等),活性氫(H)與D2O中的氘(D)可發生交換反應。通常,為確保交換反應進行完全,D2O溶液必須放置足夠長的時間或者進行多次溶解過程。氫氘交換會導致某些紅外吸收帶發生移動,甚至導致生物分子的局部構象發生變化。更為嚴重的是,由于蛋白質在D2O中的結構將有可能不同于其在H2O中的結構,觀察蛋白質在水(H2O)溶液中的結構信息和對其生理活性的研究也將缺乏實際意義。

除了用D2O溶劑,差譜技術(spectralsubtraction)也被廣泛用來扣除水峰的干擾。該技術通過對溶液的紅外吸光率譜As和溶劑水(或含水參比溶液)的吸光率譜Aw進行光譜差減,得到扣除了水吸收峰干擾的譜圖。盡管這方面的研究已經開展多年,并且目前也已成為獲得水溶液紅外光譜的主要手段,但差譜技術在光譜的重現性、偏差的不確定性等方面還存在改善空間。

測量紅外光譜時,通常要分別獲得待測樣品的單光束譜(樣品單光束譜)和參比樣品的單光譜譜(背景單光束譜),兩者的比值為待測樣品的透過率譜。根據朗伯-比爾定律,如果水在背景譜和樣品譜中完全相同,則水的吸收峰就不會出現在*終的紅外光譜圖上。但是,控制水在參比樣品和待測樣品中的數量一致是很困難的。衰減全反射(ATR)附件是目前獲得水溶液紅外光譜的常規方法。但是,到目前為止,利用ATR測量技術達成在參比樣品和待測樣品中水的有效分子總數一致是一項幾乎不可能的任務。

測量紅外光譜時,先測量溶液(K2CO3溶液或BSA溶液)的樣品單光束譜,再測量參比樣品的背景單光束譜。不同于傳統的測量方法,采集背景譜時采用了雙背景樣品。先掃描空的ATR晶體N次(N要足夠大),暫停,ATR晶體上注滿參比溶液(15%NaCl溶液或純水),繼續掃描,觀察紅外光譜圖,可以看到水的吸收峰由強→弱→消失全過程,獲得滿意的無水吸收峰干擾的紅外光譜時終止掃描。實驗路線框圖見圖1。

純水的紅外光譜與溶液中水的紅外光譜可能有些不同,包括譜帶位置,吸收峰的形狀等。因此,制備參比樣品時,要求參比樣品中水的狀態與待測樣品中水的狀態盡量一致。純水與10%BSA溶液中水的紅外光譜基本一致,因此,此情形下采用純水作為參比樣品。但10%碳酸鉀溶液中的水與純水的紅外光譜不同。根據報道,水在碳酸鉀氯化鈉混合鹽溶液中與水在氯化鈉鹽溶液中的紅外光譜非常類似,因此,10%碳酸鉀溶液情形下,選用15%氯化鈉溶液作參比樣品。

用單次ATR附件測量時,如果以空鍺晶體為參比樣品,以10%碳酸鉀溶液為待測樣品,則水在1640cm-1處的吸收峰強度大約為0.075(吸光率)。如果以15%氯化鈉溶液作參比樣品,同樣以10%碳酸鉀溶液作待測溶液,則在1640cm-1處出現負的但強度很小的水吸收峰。這是因為與15%氯化鈉溶液相比,10%碳酸鉀溶液含水量更少。吸收峰很小的原因是兩溶液含水量盡管有差異,但差異很小。

分別用不同的參比樣品(空鍺晶體或氯化鈉溶液),水的吸收峰(碳酸鉀溶液)有正有負。那么,在測量背景譜時,先用空白的鍺晶體作參比樣品,掃描多次后,暫停,然后將15%氯化鈉溶液填加到鍺晶體上,再繼續掃描,隨著掃描次數增加,會出現什么情況呢?

圖2是實驗結果。1643cm-1為水的吸收峰,1400cm-1為碳酸根(CO23+)的吸收峰。實驗中,首先測量了待測樣品10%K2CO3水溶液的樣品單光束譜,然后按照上面的敘述先用空白鍺晶體作參比樣品,掃描20次背景譜(空白鍺晶體)后,暫停。得到圖2a,這時,水的吸收峰(1643cm-1)為正值。在1,2,…,20次掃描累加中,碳酸根和水的吸收峰強度保持不變。暫停后,換上15%氯化鈉水溶液參比樣品,接著繼續掃描背景譜。增加新的掃描次數,碳酸根的吸收強度繼續保持不變(因15%氯化鈉溶液不含碳酸根)。但每增加一次新掃描,水的吸收就會稍稍減弱些(15%氯化鈉溶液含水量大于10%碳酸鉀溶液)。當對氯化鈉溶液掃描達到48次時,1643cm-1處水峰已明顯變小,如圖2b所示。每增加一次對氯化鈉水溶液的掃描,水的吸收峰都會變得更小。到掃描次數達到300次時,水的吸收峰完全消失,這時停止掃描就獲得了令人滿意的無水吸收峰干擾的紅外光譜,見圖2c。實驗中沒有采用差譜技術操作。因此,實際測量時,縱坐標可以采用吸光率,反射率或透光率等單位。

圖2c是采用ATR技術直接獲得不含水干擾峰的紅外光譜。需要強調的是,兩參比樣品的掃描順序對獲得紅外光譜的質量有重要影響?？瞻祖N晶體(含水0)與10%碳酸鉀溶液含水量差異較大,而15%氯化鈉溶液與10%碳酸鉀溶液含水量差異很小。因此空白鍺晶體作為**順位的參比樣品,先行掃描,這樣,水的IR峰表現出較大吸收峰,如圖2a。容易理解,第2階段,強的水吸收峰逐漸變小可以得到理想的扣除效果。如果15%氯化鈉溶液為**順位參比樣品,則出現的水吸收峰(負)很小但還不能小到忽略不計。第2階段,弱小的吸收峰變消失的過程(時間短暫)不利于觀察。對**順位參比樣品(空白鍺晶體)的掃描次數(N)也不能太少,掃描次數N越大,扣除效果越好,但也需要更多的累加時間。為得到滿意的信噪比,**順位參比樣品的掃描次數宜控制在20~32次之間。**順位參比樣品的實際掃描次數M必須根據被扣除水峰的強度變化來實時選擇。原則是水干擾峰信號可忽略不計時,停止掃描。

為評判新方法扣除水峰的效果,我們與傳統的差譜技術結果進行了對比。以空白鍺晶體作參比樣品,分別測量了10%碳酸鉀和15%氯化鈉溶液的紅外光譜。選擇合適的差減因子,將兩溶液的紅外光譜進行差減,得到圖3a。

從圖3比較得出,新采用的雙參比樣品方法(圖3b)效果更好,其信噪比有顯著提高,尤其在1640cm-1區間效果更明顯。雙參比樣品還有一優點就是操作簡便,可根據需要實時監控。在單次ATR附件中,雙參比樣品方法成功扣除了水的干擾,取得了很好的效果。

雙參比樣品(空白鍺晶體+水),背景譜含有水和空氣的信息。而所需要的背景譜是適宜厚度水層的信息。只有雙參比樣品的單光束譜與水的單光束譜高度相似時,雙參比方法才能取得好的效果。下面討論該方法的局限。

圖4為利用雙樣品法獲得的紅外光譜。參比樣品均為空氣,待測樣品分別為聚苯乙烯(PS)(圖4a)或雙樣品(聚苯乙烯+空氣)。圖4a為PS薄膜的紅外光譜,圖4b,c,d,e為雙樣品(聚苯乙烯+空氣)的紅外光譜。與圖4a比較,圖4b,c,d和e中的譜圖都明顯失真。即圖4b,c,d和e中的譜不能代表PS的紅外光譜?？諝馀c聚苯乙烯雙樣品的紅外光譜與純聚苯乙烯的紅外光譜何條件下才能高度相似呢?

將圖4中2000~1640cm-1區域放大,得到圖5。從圖5b,c,d和e中的譜峰與a中相對應的譜峰比較,強度不同,但峰型失真不明顯。2000~1640cm-1區域無強吸收峰,對紅外光的吸收小。因此,紅外峰的吸光率是影響失真的重要因素。越弱的吸收峰,即吸光率A越小,失真程度越小。越強的吸收,見圖4中帶星號吸收帶,失真越嚴重。

容易想象,影響失真的另一因素是雙樣品中真實物質(PS)信號在*終的光譜中所占的比例。對PS掃描M次,對空氣掃描N次,總共(N+M)次掃描。N等于零時,等于PS的譜,不失真。M等于零時,得到空氣的光譜,以PS譜作判斷標準,失真*嚴重?？梢杂肕/(N+M)來判斷失真情況,該數值等于*大值1時,不失真。M/(N+M)數值越大(越接近于1),得到累加譜的失真程度越小。

圖6給出了水的ATR譜,水和空氣的混合ATR譜。圖6中所有譜圖測量時參比樣品均為空白Ge晶體,即鍺晶體表面不加任何樣品,背景譜累積掃描32次。圖6a為水的ATR譜,采集水樣品64次。從圖6a中,發現在單次ATR附件測量中,水*強峰3400cm-1處的吸光率約為0.3,在1640cm-1處吸光率約為0.075。圖6b,c和d中樣品譜采集時分別掃描水樣品若干次外加掃描空ATR晶體若干次,因此,圖6b,c和d中的ATR譜均為雙樣品(水+空氣)混合光譜。

混合譜圖6b和6a(純水ATR譜)峰型高度相似,兩者的差減結果(圖6f)也說明了這一點。圖6b中M/(N+M)=48/（16+48）=0.75,也就是說,單次ATR附件測量時,只要M/(N+M)大于0.75,則得到的混合譜都不存在明顯失真,可用于獲得高質量的扣除水干擾的紅外光譜測量。混合譜圖6d，M/(N+M)=0.25與水的譜圖6a比較,存在明顯失真,因此圖6a與圖6d差減結果遠離理想的直線,見圖6h。實際測量中,對于單次ATR附件,只要參比溶液(例15%NaCl溶液)含水量稍稍多于待測溶液(10%碳酸鉀溶液)含水量,計算表明,采用此新方法都可以獲得無水峰干擾的高質量紅外光譜。